离子交换层析基本操作方法




 选择离子交换树脂的主要依据是被分离物质的性质和分离目的。最重要的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。一般而言:酸性物质用阴离子交换剂分离,碱性物质用阳离子交换剂分离,氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质,可根据其pI值及离子化曲线来选择。

 1.树脂的选择

     选择离子交换树脂的主要依据是被分离物质的性质和分离目的。最重要的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。一般而言:酸性物质用阴离子交换剂分离,碱性物质用阳离子交换剂分离,氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质,可根据其pI值及离子化曲线来选择。

     当目的物具有较强的碱性或酸性时,宜选用弱酸或弱碱性的树脂,这样有助于提高选择性并便于洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质,往往选用强碱或强酸树脂。对于大多数蛋白质、酶和其他生物大分子的分离多采用弱酸或弱碱性树脂,以减少生物大分子的变性,有利于洗脱,并提高选择性。

离子交换树脂

2.层析柱

     离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱,离子交换用的层析柱一般粗而短,不宜过长。直径和柱长比一般为1:10~1:50之间,层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整,不能有气泡。

 3.装柱

     先把柱内装满起始缓冲液,用玻璃棒挤压海绵,赶尽气泡并把柱子垂直固定;将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入,柱内的交换剂应非常均匀地分布,不应出现节面和气泡,不能干柱,床面要平整,床高距柱顶2~3cm为宜。

 4.平衡缓冲液

     平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合,并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。

 5.上样

     离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值,上样量也不宜过大,一般为柱床体积的1%-5%(体积分数)为宜,以使样品能吸附在层析柱的上层,得到较好的分离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出,使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样,待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样液刚好全部进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱,洗出未被吸附的物质。

 6.洗脱缓冲液

     在离子交换层析中一般常用梯度洗脱,通常有改变离子强度和改变pH值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度,从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来;而改变pH值的洗脱,对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱,阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响,故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。

 7.洗脱速度

     洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果,洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好,但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用,所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠,则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率;如果分辨率较好,但洗脱峰过宽,则可适当提高洗脱速度。

离子交换树脂

离子交换树脂

8.样品的浓缩、脱盐

     离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高,而且体积较大,样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。

     另外在层析分离过程中还要注意操作手段和溶液环境,如温度、压力和缓冲系统对欲分离物质稳定性的影响,避免被分离物质失活。

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